A genetikai betegségek továbbra is globális kihívást jelentenek, mivel azokat a gének mutációi okozzák, amelyek befolyásolják az egyedek biológiai funkcióit, anyagcsere-folyamatait vagy bizonyos esszenciális fehérjék termelését, különböző öröklött betegségekig. A génterápiás gyógyszerek olyan terápiás beavatkozások, amelyek meghatározott géneket céloznak meg, amelyek célja azok javítása vagy módosítása, és új utasításokat adnak a sejtek számára funkcionális fehérjék előállítására vagy a betegségeket okozó génhibákba való beavatkozásra.
A gyakori géngyógyszerek főként a DNS-t és az RNS-t foglalják magukban, ahol a DNS génfragmensek vagy terápiás hatású génszekvenciák lehetnek. Ezeket a DNS-eket a sejtekhez juttatják a hibás vagy hiányzó génfunkciók pótlására vagy kiegészítésére. Az RNS lehet hírvivő RNS (mRNS), kis interferáló RNS (siRNS), vagy antiszensz oligonukleotidok (ASO) stb., amelyek segítségével módosítható, gátolja a káros gének expresszióját, vagy helyreállíthatja bizonyos gének működését.
Mindazonáltal mind a DNS-nek, mind az RNS-nek számos kihívással kell szembenéznie az emberi szervezetbe való bejutástól a célsejtek eléréséig. Mivel a génszekvenciák instabilok a gyomor-bél traktusban, általában intravénás vagy szubkután injekcióban adják be, de a génszekvenciák többségét még így is lebontják az emberi szervezetben bővelkedő nukleázok.
Amikor kis mennyiségű maradék géngyógyszer eléri a célsejtek külsejét, nem tudnak bejutni a sejtekbe, mert a génszekvenciák nagy molekulák, negatív töltéseket hordozó foszfátcsoportokkal, míg a sejtmembránok negatív töltéseket is hordoznak. Amikor két negatív töltés találkozik, a gének taszítják, és nem tudnak bejutni a sejtekbe. Ezért specifikus géngyógyszer-bejuttatási módszereket kell kidolgoznunk, hogy megakadályozzuk azok in vivo lebomlását és javítsuk a sejtmembrán behatolás hatékonyságát, valamint a DNS vagy RNS szekvenciák zökkenőmentes eljuttatását a sejtekhez.
Szállítási módok géngyógyszerekhez
A jelenlegi elterjedt génbejuttatási módszerek főként két kategóriába sorolhatók: vírusvektor-szállítás és nem{0}}vírus-vektor-szállítás. A vírusvektor bejuttatása főként adeno-asszociált vírust (AAV) és lentivírust stb. tartalmaz, amelyek szimulálhatják a gazdasejtek vírusfertőzésének folyamatát, és könnyen átjuthatnak a sejtgátakon, ezáltal magas szállítási hatékonyság érhető el. Azonban a vírusvektor szállításának is vannak problémái: először is korlátozott a csomagolási kapacitása, például az AAV maximális csomagolókapacitása 4,7 kb, ami nem képes hosszabb génszekvenciákat szállítani; másodszor, a vírusvektorok súlyos immunreakciókat okozhatnak, beleértve a celluláris immunitást és a humorális immunitást, ami kockázatot jelent a klinikai alkalmazások számára. Ehhez képest a nem-vírusos vektorok óriási előnyökkel rendelkeznek a biztonság és a gyógyszerbetöltő kapacitás tekintetében.
A jelenleg általánosan használt nem{0}}virális vektorok főként liposzómákat, polimereket, nanorészecskéket, exoszómákat stb. tartalmaznak, amelyek között a liposzómák 100 nm és 1 um közötti átmérőjű amfifil molekulák által alkotott vezikulák. Főleg foszfolipidekből, koleszterinből, PEG lipidekből és kationos lipidekből állnak. A foszfolipid kettős réteg szerkezete hasonló a sejtmembránokhoz, és endocitózison keresztül simán bejuthat a sejtekbe. Ezenkívül a liposzómák módosíthatják a PEG-et vagy a specifikus antitesteket a felületükön, hogy elkerüljék a szervezet immunrendszeri kiürülését, miközben specifikus szöveteket vagy sejteket céloznak meg. A kationos liposzómák olyan liposzómák, amelyek pozitív töltésű kvaterner ammóniumsó-lipideket tartalmaznak, amelyek jobban képesek kötődni a negatív töltésű nukleinsav hatóanyagokhoz, és megőrzik a szállítórendszer stabilitását. Ezért a liposzómák a géngyógyszerek egyik elterjedt nem-vírus-vektor-szállítási módszerei.
A hagyományos liposzómáknak azonban vannak problémái is: elsősorban a liposzóma átmérőjének nagy átmérője miatt, bár ez elegendő gyógyszerbetöltő képességet biztosíthat, amikor a liposzómák áthaladnak a vaszkuláris endothel résen (100{2}}200 nm), a túl nagy méret akadályozza ezt a folyamatot. Ezen túlmenően, miután a liposzómák endocitózison keresztül bejutnak a sejtekbe, és endoszóma-lizoszóma rendszert alkotnak, a hagyományos liposzómák nem tudják időben befejezni a lizoszómális menekülést, ami azt eredményezi, hogy a legtöbb géngyógyszert a lizoszómák lebontják, és nem tudják kifejteni hatásukat. A hagyományos liposzómák ezen hiányosságaira alapozva a géngyógyszerek bejuttatásában, lipid nanorészecskéket (LNP) fejlesztettek ki, amelyek fontos szállítási módszerré váltak, különösen alkalmasak nukleinsavak célsejtekbe és szövetekbe való eljuttatására.
Bevezetés az LNP hordozórendszerbe
A lipid nanorészecskék (LNP) lipidszerű anyagokból álló nanorészecskék, amelyek átmérője általában 10-200 nm. A hagyományos liposzómákkal összehasonlítva kisebbek, és könnyebben átjutnak a vaszkuláris endothel réseken. Ezenkívül az LNP általában kationos/ionizálható lipidekből, segédfoszfolipidekből, polietilénglikol (PEG) lipidekből és koleszterinből áll. Közülük a segédfoszfolipidek és a koleszterin növelhetik az LNP stabilitását; A PEG lipidek segítenek megnövelni az LNP keringési idejét in vivo és csökkentik az immunreakciókat. Ezek a komponensek a hagyományos liposzómákhoz hasonló funkciókat látnak el. A különbség a kationos/ionizálható lipidekben rejlik, amelyek egyben az LNP szabadalmi oltalmának fő területét is jelentik.
Amint azt korábban említettük, a kationos liposzómák hatékonyan képesek fenntartani a nukleinsav gyógyszerekkel való kötődését, és javítják a nukleinsav hatóanyagok szállítási hatékonyságát. Azonban a kationos liposzómák is hajlamosak a nem specifikus kötődésre a negatív töltésű plazmafehérjékhez, vérsejtekhez stb. a test keringésében, ami liposzóma-aggregációt okoz, és gyorsan kiürül a szervezetből (a kationos liposzómák in vivo felezési ideje mindössze 15 perc).
A probléma megoldására a kutatók kifejlesztettek egy új típusú lipid anyagot, az úgynevezett ionizálható lipideket. Az ionizálható lipidek szerkezetükben nagyon hasonlóak a kationos lipidekhez. Példaként a DOTAP kationos lipid és az ionizálható lipid DODAP közül a különbség az, hogy a DOTAP egy pozitív töltésű kvaterner ammóniumsó, míg a DODAP egy tercier amin szerkezet. A tercier amin szerkezete a lipid pKa értékét 6-7 között tudja tartani. Ha a pH alacsonyabb, mint a pKa (savas körülmények között), az ionizálható lipidek pozitív töltésűek.
Ha a pH közel van a pKa-hoz (semleges körülmények között), az ionizálható lipidek semlegesek. Ezzel a kialakítással ügyesen megoldható a kationos liposzómák problémája: mivel a vérkeringés pH-ja közel semleges, az ionizálható lipidek is semlegesek, és jelentősen csökken a nem specifikus kötődés köztük és a plazmafehérjék vagy vérsejtek között, meghosszabbítva a felezési időt. Ezen túlmenően, amikor a sejtek felveszik az ionizálható lipid LNP-t, és belépnek a lizoszómákba, a lipidek ionizálódnak és pozitív töltésűek a lizoszómális környezetben, pH 5-6 mellett. A pozitív töltésű lipidek könnyen fuzionálódnak az endoszóma-lizoszóma membránnal, lehetővé téve a liposzómák kijutását a citoplazmába, disszociációt és nukleinsavak felszabadítását, ezáltal kifejtik hatásukat. Összefoglalva, az LNP hordozórendszer tervezése magában foglalja a lipidösszetétel, a részecskeméret, a felületi töltés és a stabilitás optimalizálását a hatékony génszállítás elérése érdekében.
LCMS bioanalitikai stratégia LNP{0}}csomagolt géngyógyszerekhez
Az LNP-csomagolt géngyógyszerek főként LNP-héjból és magából a géngyógyszerből állnak. Az LNP héj elsősorban lipid komponensekből áll (kationos/ionizálható lipidek kb. 30-50%, PEG lipidek kb. 2%, koleszterin kb. 20-50%, segédfoszfolipidek kb. 10-20%), míg a géngyógyszerek főként génszekvencia fragmentumokból (DNS és miRNS, siRNS) állnak. Az NMPA és az FDA legújabb előírásai[14-15] szerint az LNP-hez hasonló gyógyszeradagoló rendszerek IND alkalmazásakor a hatóanyagon (génszekvencián) végzett farmakológiai és farmakokinetikai vizsgálatokon túlmenően biztonságossági és gyógyszerészeti értékelésre is szükség van az olyan új lipidkomponensek esetében, amelyeket a gyógyszerbejuttató rendszerben még nem használtak forgalomba a forgalomba hozott gyógyszerekben, mint például a kationos/specializálható lipid-lipidek és speciális PEG-ionos lipidek.
Az LNP lipidek LCMS bioanalízise a kationos/ionizálható lipidekre és a PEG lipidekre összpontosít. A köztük lévő szerkezeti különbségek miatt a kationos/ionizálható lipid molekulatömege általában 1 kDa-n belül van, míg a PEG lipidek molekulatömege a módosítási csoportok hordozása után elérheti a 2-5 kDa-t, ami nagy különbségeket eredményez közöttük a kromatográfiás retencióban és a tömegspektrometriás válaszban. Tekintettel arra, hogy az LNP kationos/ionizálható lipid tartalma magasabb, mint a PEG lipidé, a válaszkülönbség ahhoz vezet, hogy az előkezelési módszereket (extrakciós oldószer kiválasztása, hígítási faktor meghatározása) nem lehet hatékonyan egységesíteni. Ezenkívül a PEG-lipid csúcspozíciója körüli sok zavaró csúcs jelenléte miatt gyakran hosszabb folyadékfázisú elválasztási gradiensre van szükség a hatékony elválasztáshoz, ami nem garantálja a magas elemzési hatékonyságot. Ezért a bioanalízisben külön kialakítjuk a PEG lipid kimutatási módszert. Ugyanakkor a kationos/ionizálható lipidek és a PEG-lipidek is gyakori nehézségekkel küzdenek a módszerfejlesztésben lipidkomponenseik miatt, mint például a vízben való rossz oldhatóság, a biológiai mátrix instabilitása, a fehérje kötődése a határértéket meghaladó hasznosításhoz, a PEG lipid nagy interferencia és maradéka, a lipid stabilitásváltozása a valódi mintamátrixban és a belső standard kiválasztásának nehézsége.
